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从一篇JCI说起：术业有专攻----临床科研应该怎么做？
2020-06-15 下载

我们始终认为，在基础科研领域，让临床医生和生物学家进行PK是不公平的。毕竟临床医生既缺乏时间、精力和齐全的仪器设备，也没有多年的实验技术积累。但是临床医生也有自己天然的优势，那就是临床病理样本资源。充分利用这些资源进行临床科研，不但可以不落下风，研究成果往往具有更大的应用前景。今天我们跟大家分享一篇发表在The Journal of Clinical Investigation上的文章，学习一下如何选择和利用临床样本做出高水平且有临床意义的工作。

 

研究背景和待解决的科学问题

慢性胰腺炎（chronic pancreatitis，CP）是一种不可逆的胰腺实质纤维化疾病，发生时伴有严重的腹痛，影响生活质量。酒精和吸烟被确定为成人CP的主要病因，同时遗传和其他特发性因素约占病例总数的20％，因此作者选择对CP的免疫特征进行研究。CP是目前较为常见的疾病，并且治疗费用昂贵，对病患个人、家庭和社会的影响很大，但目前尚无有效的疗法及早期诊断标志物 。目前通过细胞实验和动物模型的研究结果认为，无论CP的病因如何，CP病人的免疫反应是一致或者相似的，但这一点并没有可靠证据支持。造成这一现状的原因，主要是临床组织的缺乏，前期的研究多是通过外周血单核细胞的分析得出的结论。

因此，本研究试图通过对组织样本免疫微环境的分析来回答上述问题。作者收集了以下几种不同类型的胰腺组织：
1） 27例遗传性CP患者的胰腺组织；
2） 13例无糖尿病史的特发性CP患者胰腺组织；
3） 9名器官捐赠者的健康胰腺组织。
 

作者对上述样品进行了流式、Luminex分析和TCRβ测序，分别从组织的免疫细胞组成、T细胞组成和T细胞受体（TCR）几个不同的维度，对不同类型组织样品的免疫特征进行研究。

 

01 免疫细胞的组成

1）免疫组化实验表明，与对照组胰腺组织相比，CP中CD45+细胞明显增多。CD45+是白细胞标志物，这表明炎症组织浸润了大量的免疫细胞；

2）那么是哪些免疫细胞亚型增加了呢？流式细胞分析表明，CP的这些CD45+细胞中，CD3+ T细胞比例上升，CD68+巨噬细胞比例下降。

3）那么核心问题来了，特发性CP和遗传性CP是否和之前的研究结果一样？免疫反应是一致的吗？对CD68+巨噬细胞的含量进行分析发现：特发性CP和遗传性CP中，CD68+和CD68+CD11c+细胞在两种类型的CP样品中的占比均显著降低，在两种类型的CP样品中CD68+ CD11c-细胞的占比变高，并且特发性CP的上升程度更为显著。

 

上述结果表明，CP与健康胰腺相比，富集了更多的后天免疫T细胞；且特发性CP和遗传性CP的免疫细胞组成是有显著差异的，特发性CP组织中富集了更多的先天免疫巨噬细胞。

 

02 T细胞组成

了解了免疫细胞整体组成和先天免疫巨噬细胞的亚型差异，作者继续分析后天免疫CD3+T细胞的亚型差异。
1）与健康组织相比，CP组织中的CD4+ T细胞比例显著上升，CD8+ T细胞比例显著下降。
2）两种CP组织比较，遗传性样本中CD3+ T细胞比例高于原发性样本。
3）值得注意的是，CD4+细胞亚型，如T-bet+ (Th1)，GATA3+ (Th2)，RORγt+ (Th17/22)和CD25+FOXP3+ (Treg)，在遗传性CP样本中的克隆均得到大幅扩增，这表明功能活跃的CD4+辅助性T细胞亚群可能在遗传性CP的发病机理中起关键作用。

上述结果表明，遗传性CP富集后天免疫CD3+ T细胞。在这些T细胞中，各类辅助性CD4+ T细胞克隆数大增，表明它们可能对遗传性CP发病机理有重大影响。

 

综合上述结果我们可以发现，遗传性CP与特发性CP相比，具有更高的CD3+ T细胞比例，特发性CP比遗传性CP中CD68 +巨噬细胞增多，当我们将T细胞/巨噬细胞比例进行量化之后，这个特征就更加显著。这表明不同病因CP人群的免疫机制是不同的。

前期研究发现：TCR克隆性和多样性已被发现影响多种疾病进程，例如恶性肿瘤和自身免疫性疾病等。考虑到CP胰腺之间免疫谱的差异，作者预测胰腺浸润的T细胞中TCR谱可能发生变化，因此通过TCR-seq对两种CP组织中的TCR组成进行了研究。TCR测序一般从以下几个维度来进行分析：
1）T细胞受体的多样性和克隆性；
2）T细胞受体V-J使用规律；
3）共性或特征性TCR的发现;

 

 

 

03  T细胞受体（TCR）结构

1）TCR的多样性和克隆性
作者首先对不同类型CP胰腺组织以及对照胰腺组织中浸润的T细胞的数量、多样性和克隆性进行了分析，发现和对照胰腺组织相比：CP胰腺组织中T细胞数量显著增加（图C）、TCR多样性显著升高（图D），TCR的克隆性则显著降低（图E）。不同类型CP组织之间虽有差异，但并不显著。

 

2）TCR的V-J使用规律

接下来作者对正常胰腺组织、遗传性CP和特发性CP胰腺组织中T细胞受体的V-J使用规律进行了分析，发现：

  • (1)各组之间V-J基因家族使用的模式相当，所有组中最主要的Vβ基因家族都是TRBV7，TRBV6和TRBV5；

  • (2)对V-J使用组合规律进行分析，发现正常胰腺组织和CP组织的TCR存在9种显著差异的Vβ-Jβ基因组合，可以实现对正常胰腺组织和CP胰腺组织的有效区分；

  • (3)在不同CP类型的组织中，V-J使用是否有区别呢？对与Jβ2配对的Vβ使用频率进行分析发现，TRBV10，TRBV19和TRBV23在遗传性CP和特发性CP之间的使用频率存在显著差异；

最终作者统计了不同来源胰腺组织中功能性TCR重排的数量，并分析其与疾病严重程度之间的关系，发现功能性TCR重排的数量与CP中的疾病严重程度呈正相关。

3）共性及特征性TCR的发现

最后作者对健康和CP、不同类型CP是否有共性以及特征性的TCR进行了同源性分析，发现至少4名受试者共享20个相同的CDR3β，其中一些仅在遗传性CP患者或仅在CP患者中共享，而其他的则在对照组和CP患者中共享，所以这些序列有作为疾病诊断以及分型标志物的潜力。

上述结果表明，CP患者的胰腺组织有着非常不同的TCR免疫组库，同时不同亚型的CP也有自己的TCR特征。

 

总结

本工作中，作者通过收集不同类型CP及对照的胰腺组织，进行流式、Luminex以及TCR-seq分析，发现了CP以及不同类型CP各自免疫微环境的特征：

  • (1)CP中T细胞占比增加；而在特发性CP中，巨噬细胞的比例高于遗传性CP。这一发现表明，不同cp病因介导的免疫细胞亚群可以成为研究不同发病机制的关键因子。

  • (2)TCRβ-Seq数据显示CP中T细胞浸润增加，功能性TCR重排和克隆型多样性增加，表明CP中存在多种抗原或多克隆T细胞浸润。

  • (3)确定了在遗传性CP或两个CP组之间共享的CDR3β基序，表明局部浸润的T细胞可能存在疾病特异性的抗原。

  • (4)TCR重排计数与疾病严重程度呈正相关，这表明TCR组成可能是CP进展和严重程度的预后指标。

 

这是一篇典型的临床研究的范例，充分发挥了样本和资源优势。除了样本外，整体的实验设计、实验手段都没有难度，数据挖掘也非常简单。但其带来的临床价值并不逊于精巧严密的机制研究。术业有专攻，对于大部分有研究需求和研究兴趣的临床工作者来说，充分发挥自身优势、不以己之短搏人之长，更有利于临床研究的顺利进行。

 

参考文献：

Lee B., Adamska J. Z., Namkoong H. et al. Distinct immune characteristics distinguish and idiopathic chronic pancreatitis. J. Clin. Invest. 2020, 130(5):2705-2711.

 

 

 

 

 

 

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