组蛋白修饰中，H3K27me3修饰作为转录抑制标志被大家所熟知，但其调控转录的详细机制尚不完全清楚。这篇近期发表在Nature Communication上的文章报道，含BAH结构域蛋白AIPP3和含PHD结构域蛋白AIPP2/PAIPP2协同识别拟南芥中的H3K27me3和未修饰的H3K4组蛋白，同时，该BAH-PHD还与磷酸酶CPL2形成复合体（BAH-PHD-CPL2 complex，BPC），通过对Pol II去磷酸化，阻碍Pol II从转录起始位点释放，从而抑制基因转录。本文首次将组蛋白修饰与Pol II去磷酸化关联了起来，下面就来跟小编一起，围观作者解析这个表观调控机制的思路和方法吧。
研究背景和待解决的科学问题
真核生物中，组蛋白修饰H3K27me3作为常染色质中的广泛存在的抑制性表观遗传标记，在多种生命过程中发挥了重要作用，但其抑制转录的机制还未完全揭示清楚。有研究表明，含BAH结构域的蛋白和PHD结构域的蛋白能够各自分别结合多种修饰组蛋白，但在植物中，这两类蛋白是否参与识别组蛋白修饰，是否介导了转录抑制，目前还没有报道。
因此，本文想要解决的科学问题，就是想研究含BAH结构域的蛋白AIPP3和含PHD结构域的蛋白AIPP2/PAIPP2蛋白是否识别组蛋白修饰，以及是否介导了下游基因的转录抑制。如果的确介导了转录抑制，其机制又是什么？
研究思路解析
1. BAH-PHD-CPL2以复合物形式调控了基因表达，影响拟南芥开花
免疫沉淀质谱和酵母双杂技术验证复合体成员之间的结合作用。结果表明PHD结构域蛋白AIPP2/PAIPP2蛋白各自独立与AIPP3和CPL2形成复合体，但AIPP2和PAIPP2蛋白之间无相互作用（下图a、b、c）。
前期研究表明，开花抑制基因FLC和开花促进基因FT上的H3K27me3修饰对开花的时间有显著调控。因此，作者构建了BPC中的单体单突变体（aipp2-1、paipp2-1、aipp3-1、cpl2-2）及多体突变体（aipp2-1/paipp2-1、aipp3-1/aipp2-1/paipp2-1、cpl2-2/aipp2-1/paipp2-1、aipp3-1/cpl2-2），来研究BPC参与调控的开花情况。
结果表明，BPC突变体aipp3-1、cpl2-2、aipp2-1/paipp2-1发生多种严重发育缺陷，如矮柱、叶小和不育等，表明该复合体对于植物的正常发育是必须的。不过，aipp2-1和paipp2-1突变体发育缺陷不严重（见下图a）。
与野生型Col-0相比，不论是长日（long day，LD）还是短日（short day，SD）光周期，aipp3-1和cpl2-2突变体在明显较早开花。aipp2-1和paipp2-1突变体的开花时间与Col-0差异较小，但aipp2-1/paipp2-1双突变体的开花时间与aipp3-1和cpl2-1类似（见下图b、c），表明AIPP2和PAIPP2这两种PHD蛋白存在冗余性。
抑制因子FLC通过结合开花促进基因FT和SOC1来抑制开花。RT-qPCR实验表明，FLC RNA表达量在aipp2-1、paipp2-1、aipp3-1、cpl2-2和aipp2-1/paipp2-1这些突变体中均下调，FT在aipp3-1、cpl2-2和aipp2-1/paipp2-1表达上调，但在aipp2-1和paipp2-1未上调，进一步表明AIPP2和PAIPP2存在冗余。但SOC1表达量在突变体中未见显著变化（见下图e）。
为了进一步弄清楚FLC和FT与BPC的关系，在BPC突变体的基础上，作者进一步构建了FLC和FT的突变体，发现以开花时间论，aipp3-1/flc-3、cpl2-2/flc-3和aipp2-1/paipp2-1/flc-3与aipp3-1、cpl2-1和aipp2/paipp2的表型相近，都比单突变体flc-3提前了更多（下图e）。与之形成强烈对比的是，FT突变ft-10挽救了BPC突变体的提前开花表型，推后了开花时间（下图h）。
以上结果表明，BPC主要通过抑制FT基因的表达来抑制开花。
2. BPC复合体与修饰组蛋白的结合
确认了BPC调控FT之后，由于前期研究已证实BHA和PHD结构域能识别组蛋白修饰，那么BPC调控基因表达是否与组蛋白修饰有关？作者检测了BPC组成蛋白与多种修饰组蛋白的结合能力：
pull-down实验表明，AIPP3-BAH可以特异性结合H3K37me1/2/3（见下图b），等温滴定量热（isothermal titration calorimetry，ITC）确认AIPP3-BAH与H3K27me3结合能力最强（见下图c）。
ITC表明PAIPP2特异性结合未修饰的H3K4（见下图i）。
上述实验表明，BPC具备识别H3K27me3/H3K4组蛋白的能力，可能通过识别组蛋白修饰，介导了基因的转录调控。
3. BPC通过H3K27me3/H3K4介导基因表达调控
作者先检测了BPC突变对基因表达的影响，研究受影响的基因上组蛋白修饰的特点。为了对比，作者还构建了H3K27me3的甲基转移酶CLF突变体clf-81，以及H3K27me3 reader蛋白LHP1突变体lhp1-3。
野生型和BPC突变体的RNA-seq数据显示，除aipp2-1和paipp2-1之外，突变体大量基因表达上调（远多于下调基因），表明BPC是一个转录抑制复合体（见下图a）。
ChIP-seq数据表明，H3K27me3显著富集于突变体上调基因（见下图e）,而H3K4me3在这些基因的TSS区域未见明显富集。
ChIP-qPCR和ChIP-seq显示，突变体中显著上调的BPC典型靶基因上富集了AIPP3、AIPP2和PAIPP2蛋白（见下图a、b）。在全基因组范围，AIPP3的结合峰也富集于aipp3-1突变体显著上调的基因上（见下图c、d）
在AIPP3结合的基因中，能清楚地观察到高H3K27me3和低H3K4me3的分布模式（见下图e）。
为了进一步证明结合H3K27me3组蛋白是BPC调控开花基因表达的必要条件，作者构建了突变体，破坏了AIPP3-BAH与H3K27me3的结合能力，研究开花表型。
ChIP-qPCR表明，W170A突变削弱了AIPP3与BPC典型靶基因的结合（见下图e）。
AIPP3-BAH结合位点突变体W170A和Y149A/W170A/Y172A表现出与敲低突变体aipp3-1一样的早花表型（见下图a、b）
RT-qPCR表明，AIPP3能挽救突变体aipp3-1的表达变化，但W170A突变无法挽救（见下图d）。
以上结果表明，AIPP-BAH对H3K27me3的结合是调控靶标基因的必要条件。
4. BPC识别组蛋白修饰与Pol II磷酸化偶联
以上解析了BPC识别H3K27me3标记基因，调控其表达，但具体的转录调控机制是怎么样的？前期研究表明，在转录过程中，Pol II首先在启动子区域组装。转录开始后，Pol II Ser5和Ser2处被磷酸化，然后从近端启动子区域释放，继续RNA延伸。CPL2能在Ser5处脱磷酸化，因此，作者假设BAH和PHD识别H3K27me3和未修饰的H3K4，介导CPL2对Pol II去磷酸化，从而抑制转录。
作者对BPC靶基因转录起始位点的Pol II磷酸化水平进行了分析：
BPC典型靶基因（AGO5、SUC5和FT）转录起始位点富含末端未磷酸化的Pol II，而Ser5P-Pol II和Ser2P-Pol II的水平很低（见下图a）；
BPC突变体中，典型靶基因转录起始位点富集的Ser5P-Pol II和Ser2P-Pol II水平显著上调（见下图b）。
作者构建了CPL2-GFP/Col-0，CPL2-GFP/aipp3-1和CPL2-GFP/aipp2-1/paipp2-1植株，ChIP qPCR证明，CPL2-GFP/Col-0结合BCP靶基因，但aipp3-1和aipp2-1/paipp2-1完全不结合这些基因。
以上结果表明，CPL2对BPC靶基因的结合依赖于BAH和PHD蛋白。
上述实验揭示了BPC识别H3K27me3靶基因对CPL2的招募过程，将靶基因转录起始位点的Pol II的磷酸化水平及转录效率与BPC识别H3K27me3相偶联，揭示BPC转录抑制调控机制（见下图）。
总结
本文首次将H3K27me3的识别直接与Pol II CTD的磷酸化调控相偶联，作者在证明BPC作为组蛋白修饰reader调控转录的思路和方法上是非常出彩的。最后我们再一起回顾下这篇文章的研究思路吧：
- 通过免疫沉淀质谱和酵母双杂证明了BAH-PHD-CPL2复合物成员之间的结合。BPC突变体表现及遗传学研究确认BPC复合体通过转录抑制调控关键生理过程。
- 通过pull down和ITC确定BPC结合的组蛋白修饰为H3K27me/H3K4me0。
- 通过RNA-seq及ChIP seq数据分析表明BPC转录抑制调控基因富集了H3K27me3修饰。
- 验证BPC与H3K27me3的结合是调控靶基因表达及相关生理表型的必要条件。
- 证明了BPC对H3K27me3靶基因的表达调控与CPL2介导的Pol II 的磷酸化转录调控相偶联。
文章思路层层推进，选择实验的目的非常清楚，最终揭示BPC介导的H3K27me3抑制转录分子机制，工作扎实、漂亮，值得广大机制研究者揣摩和借鉴。
参考文献：Zhang YZ,et al. Coupling of H3K27me3 recognition with transcriptional repression through the BAH-PHD-CPL2 complex in Arabidopsis. Nature Communications（2020）.
