很多科研工作者觉得，高分文章难以发表的一个重要原因就是要有大量各种实验支撑。但实验要耗费大量时间精力，所以高分杂志令人望而生畏。这个想法可能有一定道理，但也不尽然。今天我们就来看一篇Nature Communications，看看在实验简单直接、仅有测序数据的情况下，如何完成一项漂亮研究。
研究背景和待解决的科学问题
肾移植是终末期肾病和慢性肾病的首选治疗方法之一。但是，急慢性排斥反应均可能导致长期移植效果欠佳。预测移植结果目前仍是一个未解决的难题。T细胞在器官移植排斥反应中的角色已有不少研究，B细胞及相关抗体在激发排斥反应中的作用也越来越受到重视。
B细胞受体测序（B-cell receptor sequencing，BCRSeq）是一种高通量测序技术，能对数百万免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）区域平行测序来研究免疫反应。尽管BCRseq已应用于多发性硬化、流感疫苗及免疫缺陷疾病等研究中，但缺乏在移植排斥反应的研究。
因此，作者通过对肾移植患者外周血免疫系统的分析，研究体液免疫应答在器官移植排斥反应中的情况。作者收集了3个临床组共27例患者的外周血样本，临床分组标准由blinded central pathology reads of serial allograft biopsies scored by Banff criteria以及chronic allograft damage index (CADI) score定义：
- （病情）无进展者（Non-progressors，NP，n = 10），无排斥反应；
- 有进展无排斥者（Progressors with no rejection，PNR，n = 10）；
- 有进展且排斥者（Progressors with rejection，PR，n = 7）。
从81例外周血（0，6，24个月）提取了gDNA以及其中的55例样品的PBMC中提取了RNA，进行了gDNA和cDNA的BCRseq。
移植前B细胞多样性与排斥相关
作者用丰富度（特异性BCR的种类数）或者香农信息熵（Shannon Entropy）来衡量B细胞的多样性。如下图a所示，移植前，PR组多样性显著高于NP组，这种趋势在移植后6个月仍得已保留，24个月后差异不显著。cDNA的BCRseq结果显示，这种多样性的显著差异主要来源于IgD（下图b）。
·临床表现不同，B细胞多样性时间变化趋势不同
- 如下图a所示，gDNA的BCRseq显示，随着时间推移，NP组B细胞多样性提高、PR组下降、PNR组变化不显著。
- 如下图b所示，cDNA的BCRseq也与gDNA结果一致，趋势最明显的是IgM和IgD。
B细胞网络在克隆扩增方面有差异
根据B细胞受体的序列多样性，作者为每个样本绘制了B细胞受体网络。网络中的每一个点代表一个独特的BCR，点的大小代表了该BCR序列的数量。当顶点属于同一个克隆（同一个克隆定义为一组来自共同祖先分子的细胞，这些祖先分子具有相同的IGHV和IGHJ片段，相同的CDR3长度以及CDR3的90％核苷酸序列相同）时，顶点之间用线连接，来源于同一个克隆的相互连接的顶点组形成一个B细胞簇。
作者使用基尼指数（gini index）来量化网络，Gini（V）量化顶点均一性，Gini（C）量化簇均一性，指数范围0~1，越接近1，说明网络越不均衡。
下图展示了3个临床组中各1个例子的B细胞受体网络：
- 与NR组相比，PR组有更多更大的点，更多的克隆簇，说明其独特BCR序列的数量更多，克隆数更多；
- 与NR组相比，随着时间推移，PR组BCR种类减少；
- 如下图所示，不论是Gini（V）还是Gini（C），PR组相对于NR组和PNR组的基尼指数更高，这表明PR组不仅在移植前的克隆扩增较高，移植后的某些特定BCR克隆扩增程度很高。
某些IGHV基因与排斥反应有关
作者对免疫球蛋白重链V区（IGHV）基因的序列特异性进行分析。通过统计学检验的过滤，作者筛选到共27个可能与排斥反应相关的IGHV基因：时间点0有3个、6个与有7个以及24个月有16个（下图a~c）。
在NP vs PR的比较中，IGHV3-23是所有三个时间点中最重要和最丰富的基因（下图d）。因此，IGHV3-23的表达有用于监测移植肾免疫反应的潜在可能。
总结：
本工作中，作者收集不同临床表现肾移植病例外周血标本，进行了BCRseq研究分析，发现在移植排斥病例中，移植前的B细胞多样性较高，随着时间推移，某些克隆扩增，某些IGHV基因使用增加，B细胞受体多样性降低。
- 移植后病情稳定者（NR组）B细胞多样性低，这可能帮助预测移植后的排斥反应，以及制定移植后免疫抑制的策略；
- PR组中，IGHV3-23使用频率显著高于NR组，因此，IGHV3-23的表达有可能被用于监测肾移植的免疫反应。
这篇文章中，总共只做了81例gDNA和55例cDNA的BCRseq，但作者把这些测序数据利用得非常充分，从各个不同层面挖掘了数据的意义，结论不仅有说服力，也很有临床指导意义，值得研究者们，尤其是一线临床科研同志们学习体会。
参考文献：
https://doi.org/10.1038/s41467-019-09930-3
