互作转录组是一门研究病原体和宿主间相互作用关系的科学。近几年，基于建库和测序分析技术的提升，互作转录组测序已广泛应用于互作模型的相互作用和调控机制研究。互作转录组和普通转录组测序的主要区别在于，互作转录组不分离不同物种，同时对宿主和病原体进行测序和分析，准确获取互作物种间基因的调控关系，从而研究两者相互作用机制。
由于互作转录组中病原体mRNA的比例要比宿主少得多，因此难点在于获得病原体足够深度的测序数据。为了解决这个问题，目前已经发展出了几种不同的策略：选择性的裂解宿主细胞、调取宿主转录本以及加大混合样本的测序深度等。
这篇2020年发表于Cell Reports上的Dual RNA-seq文章，采用了选择性裂解宿主细胞、富集微生物mRNA的策略，有效增加了微生物的测序reads。我们一起来浏览下吧~
研究背景
大多数互作转录组测序研究涉及感染细胞系或分化的原代细胞，虽然很有价值，但这些研究并未解决宿主体内细胞异质性的问题。对于许多病原体而言，异质性对于感染的控制或进展至关重要。这对于结核分枝杆菌（Mtb）等病原体具有重要的意义。对于这些病原体，细菌的存活和生长与结核肉芽肿中共存的不同巨噬细胞谱系的个体发育和代谢有关。
在这项研究中，作者直接从感染的小鼠肺中分离出结核分枝杆菌感染的不同类型的巨噬细胞，并进行了互作转录组测序。宿主和细菌的转录在维持结核分枝杆菌生长的肺泡巨噬细胞（AM）和限制结核分枝杆菌生长的间质巨噬细胞（IM）之间分化了。
研究结果
- RNA富集
作者首先分离出两种感染结核分枝杆菌14天时的不同肺巨噬细胞谱系（AM和IM），分别占总巨噬细胞的9％和2％（图1A）。
为了富集病原体RNA，作者使用TRIZOL裂解宿主细胞、保留完整Mtb，离心，分离宿主细胞RNA和Mtb，并通过GTC（异硫氰酸胍法）对RNA进行纯化，制备高纯度RNA。之后使用Glycoblue（Invitrogen），以最大限度提高RNA的回收率用于文库制备（图1B）。
图1
- Mtb小鼠体内转录特征的鉴定
作者对感染Mtb小鼠Dual RNA-seq数据进行分析，发现在in vivo巨噬细胞中有180个特异性上调的标识基因（图2-1）。
图2-1
通过通路分析发现，在体内感染Mtb时，宿主特异性上调的基因主要与胆固醇稳态、氮同化、一氧化氮解毒、蛋白质和脂质输出有关。Mtb在体内感染期间，与胆固醇降解（Kstr2）有关的15个基因在IMs和AMS中均显著上调（图2-2左），说明胆固醇被完全降解为细菌供能。参与结核菌醇二分支菌酸（PDIMs，Mtb细胞壁脂类组分）合成和转运的基因在体内也有特异性上调（FADD26、PPSA-PPSE、MMPL7和Rv2943）（图2-2右）。PDIM通路在病原体-宿主的相互作用过程中扮演重要角色，尤其是在细菌的早期侵染及进入巨噬细胞环节中发挥积极作用。
图2-2
- Mtb感染和未感染的不同细胞的转录模式
在前期的研究中已发现，AM比IM更有利于细菌的生长。为了详细了解两种宿主细胞系之间的转录差异，作者直接比较了被Mtb感染的AM和IM中，细菌和宿主RNA-seq结果（图3），共有319个Mtb基因上调（IM中上调223个，AM中上调96个），宿主细胞中，IM有3732个差异表达基因，AM有4097个差异表达基因。
图3
- Mtb感染AM的宿主和细菌转录情况
对感染后AM上调的通路进行分析，在感染14天时，NRF2通路在感染的AM中上调（图4-1）。NRF2与促炎反应减少和抑制细菌生长能力的功能损伤有关。
图4-1
通过海马生物能量测定仪分析从Mtb感染的小鼠肺中分离出的AM和IM的细胞代谢情况，与IM相比，AM表现出更高的基础和最大耗氧率（OCR），表明Mtb影响了氧化磷酸化和线粒体活性（图4-2）。使用脂肪酸氧化抑制剂（ETO）抑制脂肪酸氧化途径后，AM中的最大OCR降低到基础水平，而ETO对IM中的OCR没有影响（图4-2）。AM和IM线粒体活性之间的差异验证了RNA-seq数据，表明脂肪酸代谢在AM中更活跃。
图4-2
总结以上结果：在感染后的第14天，受感染的AM代表了更适合细菌生长的宿主细胞状态，病原体参与细胞生长和分化，核糖体蛋白合成，以及细胞壁合成的基因，发生了显著上调（图4-3）。此外，在大量游离脂肪酸、甘油和甘油三酯的背景下，细菌参与脂肪酸摄入、乙醇酸的生物合成、脂质降解、三羧酸循环和β氧化的相关基因发生上调（图4-4），提示脂肪酸氧化可能是AM中Mtb生长所需能量的首选途径。
图4-3
图4-4
- IM抑制Mtb生长
观察受感染IM细胞中差异表达的通路，泛素化、NO/活性氧生物合成、分泌因子、糖酵解和炎症反应相关的基因显著上调；与钾和氯化物转运有关的途径，即Mtb存活所需的两种无机离子被下调（图5）。这些数据均表明，IM细胞抑制Mtb的生长。
图5
- 铁代谢是区分AM和IM中Mtb感染的显著转录特征
宿主和病原体中均观察到与铁代谢相关基因的转录特征（图6）。在AM中，Mtb高表达铁螯合蛋白BfrB；Rv0452是mmpS4和mmpL4铁载体输出蛋白的转录抑制子，在Mtb中高表达。而IM细胞中的Mtb显示出与低铁条件相关的转录特征。而在宿主的转录组数据中，可发现在限制Mtb生长的IM中，Spi-C、Scara5基因显著上调。Spi-C转录抑制子以血红素依赖的方式在脾脏红髓巨噬细胞中上调，为降解衰老红细胞和回收血红素铁所必需。AM显示转录因子Myc的表达增强，Myc的高表达与铁释放有关；此外，编码几种含铁、铁利用和铁调节线粒体蛋白的mRNA表达上调，表明这些细胞线粒体活性强。
图6
总结
本研究的创新之处在于直接从感染14天的小鼠肺中分离出两种不同的宿主细胞，生成宿主和细菌的转录数据，结合宿主细胞异质性，展示了宿主和病原体在体内感染两种不同的巨噬细胞谱系时的转录反应。通过差异基因、通路注释和构建蛋白互作网络等分析手段，进一步阐明了为什么AM是Mtb增殖的首选巨噬细胞类型。
在本研究中，作者研究了小鼠感染过程中的一个时间点，虽然这种分析需要扩展到后期时间点，但它证实了宿主组织异质性对病原体的影响，仍很有价值。
参考文献：
Pisu D , Huang L , Grenier J K , et al. Dual RNA-Seq of Mtb-Infected Macrophages InVivo Reveals Ontologically Distinct Host-Pathogen Interactions. Cell Reports, 2020.
