超级增强子(Super enhancer, SE)作为成簇的转录激活顺式调控元件，在癌症发生、细胞分化、免疫应答等重要生理过程中发挥关键作用。因此，利用ChIP seq鉴定肿瘤细胞中超级增强子元件，进而筛选关键调控因子，是一种高效肿瘤机制研究手段。
下面有这篇近期发表在Nature communications上的文章, 就是运用ChIP seq研究肿瘤机制的经典案例，作者通过组蛋白ChIP seq鉴定间变性大细胞淋巴瘤（anaplastic large cell lymphoma，ALCL）中特有的超级增强子，筛选到肿瘤生长关键调控因子BATF3，并进一步通过ChIP seq和RNA seq联用筛选BATF3的直接靶标基因，最终解析了BATF3/IL-2R在ALCL肿瘤中的作用机制。
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研究背景和待解决的科学问题
系统性间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)是一种侵袭性CD30阳性恶性的T细胞淋巴瘤，根据有无间变性淋巴瘤激酶(ALK)融合可分为ALK阳性(ALK+)和ALK阴性(ALK−)ALCL, 尤其会危害儿童和年轻成年人的健康。
除了常规的化疗方案外，针对肿瘤特定靶点的精准靶向药物治疗策略是目前主要的治疗手段，如CD30抗体偶联药物（antibody-drug conjugate，ADC），但一些特定系统性ALCL亚型的预后并不令人满意，寻找新的治疗靶点及广泛适用的癌症疗法非常值得研究。
超级增强子在肿瘤增殖中具备超强的转录调控功能，肿瘤中特异的SE往往驱动肿瘤细胞关键致癌基因的表达。超级增强子的鉴定主要手段是通过ChIP seq检测转录活性标记分子在全基因组的富集，如组蛋白修饰标记的H3K27ac、H3K4me1，染色质修饰P300等。
本文想要解决的科学问题就是通过ChIP seq超级增强子鉴定筛选调控ALCL肿瘤生长的关键因子，进一步解析寻找新的ALCL候选治疗靶点。
研究思路和结果
一、ALCL中特异超级增强子（SE）分析获得候选ALCL关键调控因子。
作者首先采用ChIP seq检测8种ALCL细胞系(5 ALK+， 3 ALK−)全基因组水平上H3K27ac修饰分布水平，通过超级增强子分析软件ROSE筛选SE。
1. 在Karpas-299 和Mac-1 中分别鉴定到538和722个超级增强子(下图a);
2. 两者共有的SE关联基因通过韦恩图进行展示，其中包含 BATF3、IL-2RB以及已知的ALCLH肿瘤相关基因，如CD30（下图c）。
3. IGV可视化图展示了BATF3关联的SE区间分布，伴随很强的H3K27ac信号分布（下图b）；
4. BATF3、IL-2RA和/或IL-2RB基因关联的SEs特异存在于ALCL细胞系，在正常T细胞系未观察到（见下图）。
5. 此外，作者在原代ALCL组织样品中也发现了类似的的SEs模式（下图d）。
ALCL组织及细胞系特异的超级增强子关联基因中均包含BATF3和IL-2R基因，暗示BATF3和IL-2R可能与ALCL肿瘤相关。
二、BATF3及IL-2R亚基在ALCL中特异高表达维持细胞增殖活性。
为了进一步确认BATF3和IL-2R在ALCL中的功能，作者分析了ALCL病例样本中BATF3及IL-2R亚基的表达情况，并通过生理实验检测BATF3对ALCL细胞增殖的影响。
1. 免疫化学染色（IHC）定量结果显示，BATF3蛋白IL-2R蛋白亚基在ALCL组织中特异高表达（见下图）。
2. 蛋白(IHC)及转录水平(RNA seq)相关性分析表明BATF3和IL-2R亚基在ALCL病例组织中的表达呈正相关。
3. BATF3敲除及回补实验表明BATF3正调控ALCL细胞的增殖。
上述结果表明BATF3在ALCL中高表达能够促进ALCL的增殖；BATF3作为转录因子与IL-2R表达呈正相关，暗示BATF3和IL-2R在ALCL活性维持中存在关联性。
三、BATF3蛋白直接靶标并调控IL-2R及CD30基因表达。
由于BATF3与IL-2R在ALCL表达存在相关性，转录因子BATF3可能调控IL-2R亚基基因的表达。为了验证这一猜想，作者通过RNA seq与ChIP seq联用，筛选BATF3蛋白的直接靶标基因。
1. RNA seq检测发现BATF3敲除会导致IL-2R亚基基因及CD30(ALCL标志基因)显著下调（下图左），且下调基因通路富集到IL-2（IL-2R识别上游信号因子）介导的信号通路（下图右）。
2. qPCR验证了ALCL细胞系中BATF3对IL-2R亚基基因的转录调控。
3. ChIP seq可视化结果显示BATF3蛋白和H3K27ac（SE组蛋白标志性修饰）在靶标基因IL-2RA，IL-2RB及CD30上的共分布。
4. ChIP-qPCR验证了BATF3在IL-2RA，IL-2RB及CD30基因启动子或超级增强子区域有富集。
5. 凝胶迁移（EMSA）实验证明了BATF3蛋白与IL-2RA和IL-2RB有相互作用。
上述结果表明，BATF3直接结合并促进靶标基因IL-2RA/B及CD30在ALCL中的表达。
四、IL2/15-IL-2R促进ALCL生长并激活STAT1/5和ERK信号通路
既然BATF3在ALCL中促进IL-2R亚基的表达，那么IL-2R是否与BATF3对ALCL的生长调控相关？为了解答这个问题，作者从IL-2R的上游激活信号因子IL2/IL15入手，验证其对ALCL的调控作用。
IL2和IL15的识别受体共用IL-2Rα和IL-2Rβ两个亚基 ，其中IL-2R的三个亚基IL-2Rα，IL-2Rβ和IL-2Rγ组成IL-2的受体；IL15受体则由IL-2Rα，IL-2Rβ和IL15γ组成。
1. 重组IL2（rhIL-2）处理可以促进大部分ALCL细胞系的增殖（下图a），且这一过程依赖于BATF3（下图b）。
2. Neo-2/15（IL2类似物）处理对ALCL生长促进效果与rhIL-2效果一致。
3. IL2处理能特异性增强ALCL细胞中STAT1/5(ALCL标志性基因)及ERK1/2的磷酸化水平（下图c）并影响细胞增殖（下图d），而特异性识别IL-2Rα并阻碍其与IL-2结合的抗体basiliximab可以削弱IL-2的作用(下图e)。
4. IL-15处理ALCL细胞系表现出与IL-2一致的生长促进效应。
上述结果表明，IL2/15-IL-2R促进ALCL细胞生长及ALCL相关信号的激活，故IL-2RA可能成为ALCL治疗的候选靶标。
五、IL-2RA的表达与ALCL病人生存相关，是潜在的治疗靶点。
鉴于IL-2/IL-2R在ALCL中的作用，作者进一步探究了IL-2Rα作为ALCL治疗靶点的可能性。
1. ALCL肿瘤中高表达IL-2RA的患者生存率显著降低。
2. 作者比较IL-2Rα抗体偶联靶向药物ADCT-301与非IL-2Rα靶向ADC（B12-SG3249）对ALCL的处理效果，结果发现ADCT-301诱导了ALCL细胞系的死亡。
3. ADCT-301可以抑制ALCL机体（动物肿瘤模型）中肿瘤的生长。
上述结果表明IL-2Rα可以作为ALCL肿瘤治疗的候选靶点。
总结
本文通过ChIP seq超级增强子鉴定，筛选到ALCL肿瘤关键的调控因子BATF3/IL-2R，进一步采用ChIP seq及RNA seq联用解析了BATF3转录激活IL-2R基因在ALCL中的表达机制。作者运用生理及生化实验证据描绘了IL2/IL-2R信号通路在ALCL中促癌作用模型（见下图）。值得强调的是，本研究表明IL-2Rα能作为治疗ALCL的一种潜在新靶点。
文章利用ChIP seq筛选关键调控因子和研究转录调控的思路非常值得学习借鉴。ChIP seq—蛋白核酸互作研究利器，认准康测科技！
