研究背景
RNA修饰是表观遗传中影响转录后调控的关键过程，例如RNA m6A修饰的研究正进行得如火如荼。除此之外，人们也发现包括ac4C在内的多种RNA修饰均可参与转录后调控过程。前期研究发现，RNA腺嘌呤和胞嘧啶上甲基化修饰是细胞、病毒mRNA的关键调节因子，但其他修饰——如ac4C——是否发生在宿主及病毒中，并参与调控病毒的侵染过程还不得而知。
本文所关注的问题，就是ac4C乙酰化修饰是否存在于HIV-1病毒上；如果存在，这一修饰是否在HIV-1病毒感染过程中起到某种调控作用。
1. HIV-1病毒上存在ac4C修饰
为了了解HIV-1病毒基因组RNA上是否存在ac4C修饰，作者先进行了acRIP-seq，发现HIV-1病毒基因组RNA上存在多处修饰（下图A、B）。
此前研究表明，ac4C修饰是由乙酰转移酶NAT10介导发生的，因此作者通过CRISPR/Cas技术敲低了NAT10，acRIP-seq检测发现，NAT10敲低后，HIV-1上ac4C修饰的确减少了（下图C）。
此外，作者还通过PAR-CLIP检测了NAT10-FLAG和GFP-FLAG（阴性对照）过表达细胞中蛋白NAT10所结合的RNA，而NAT10-FLAG中NAT10与病毒转录本结合的区域，同HIV-1病毒具ac4C修饰的区域一致（下图D）。
上述结果表明，HIV-1的RNA上的确具有ac4C修饰，且这一修饰由NAT10介导。
2. HIV-1上的ac4C修饰可促进病毒复制
在确定了HIV-1病毒存在ac4C修饰后，这一修饰是否能促进病毒的感染过程呢？如果NAT10介导的ac4C修饰可以促进HIV-1病毒转录，那么NAT10的敲低或许能抑制HIV-1转录。基于上述假设，作者检测了病毒Gag蛋白的表达情况：NAT10敲低后，病毒Gag蛋白的表达显著减少（下图A），荧光素酶、RT-qPCR等实验结果均与之一致，NAT10敲低细胞中的荧光素水平、病毒RNA表达量均显著降低（下图B, C），表明NAT10表达减少会显著降低HIV-1病毒的基因表达。
作者也利用NAT10抑制剂——Remodelin进行了探究，发现在正常细胞中，添加该抑制剂后可降低70%的HIV-1复制，而对于NAT10敲低细胞中的病毒复制无显著作用（下图D）。这也进一步证实了NAT10是HIV-1病毒的辅因子。
由于NAT10表达降低导致HIV-1复制减少，作者推断NAT10的乙酰转移酶活性可能是HIV-1复制的限制因素。因此，作者分别构建了NAT10和丧失乙酰转移酶功能的NAT10（K290A、G641E）的荧光素酶报告系统（下图E），结果显示乙酰转移酶功能的丧失并不影响NAT10的蛋白表达（下图G），但影响了病毒报告系统中的荧光素表达（下图F），表明NAT10的乙酰转移能力对HIV-1病毒的复制具有重要作用。
3. NAT10对HIV-1病毒转录本的影响
为了研究NAT10介导的ac4C修饰在哪一个阶段促进HIV-1复制，作者进行了HIV-1单一周期复制实验，在用逆转录酶抑制剂Nevirapine处理后，NAT10敲低细胞中HIV-1病毒的Gag蛋白表达、RNA表达量均远低于对照组（下图A、B），暗示NAT10可能从转录水平影响HIV-1病毒，进而促进病毒复制。
此后作者通过亚细胞定位、qPCR等实验证明，NAT10敲低既不影响HIV-1病毒的DNA量（下图C），也不影响HIV-1转录本的亚细胞定位（下图D），表明ac4C修饰程度降低不影响病毒进入宿主细胞、逆转录、整合及其亚细胞定位等过程。
但是，NAT10敲低导致的ac4C修饰程度降低，使得病毒RNA稳定性大幅降低（下图E）。表明NAT10介导的ac4C修饰可通过维持HIV-1病毒转录本稳定性，从而促进病毒相关基因表达，帮助病毒的复制。
4. 病毒基因组RNA上的ac4C修饰有助于病毒相关基因的表达
此前研究发现，ac4C除了通过影响转录本稳定性以外，还可以提高CDS区翻译效率。是否只有发生在CDS中的ac4C修饰可以顺式作用的方式影响mRNA稳定性呢？作者对HIV-1 env 基因3’UTR的ac4C位点进行了突变（C-U，下图A），之后用突变体病毒转染WT 293T细胞，检测病毒Gag蛋白表达量。结果显示，ac4C修饰位点突变后，Gag蛋白表达量下调（下图B），且病毒的释放量也显著降低（下图C）。这说明3’UTR的ac4C修饰位点的也调控了HIV-1病毒的Gag蛋白表达。
综上，文章得到一个简要模型：HIV-1病毒可借助宿主体内的乙酰化转移酶NAT10在其基因组RNA相应区域进行ac4C修饰，而这一修饰可维持病毒mRNA的稳定性，从而上调病毒蛋白的表达量，促进病毒的复制。而当NAT10乙酰转移功能缺失或3’UTR ac4C位点突变后，病毒的转录本稳定性下降，从而抑制了病毒的复制。
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参考文献：doi:10.1016/j.chom.2020.05.011
