由S. sclerotiorum引起的核盘菌茎腐病（SSR）在世界范围内对油菜籽（Brassica napus L.）造成了毁灭性的经济损失。核盘菌低毒相关DNA病毒1（SsHADV-1）是一种环状单链DNA病毒，SsHADV-1的感染能导致其宿主核盘菌DT-8毒力低下、生长速度降低和其他菌落形态变化。然而，SsHADV-1导致菌核菌毒力下降的机制仍不清楚。本研究中，作者利用康测科技unique molecular identity RNA-seq (特异性分子标签转录组测序，以下简称UMI RNA-seq，/list/10.html）进行转录组分析，以阐明DT-8响应SsHADV-1感染的内在机制。那么作者是如何通过转录组测序来揭示这一过程呢？让我们跟随小编的脚步来领略吧~

研究思路

1. 转录组数据总览

首先，作者对携带SsHADV-1的核盘菌低毒株DT-8和无毒菌株DT-8VF样本分别进行了UMI RNA-seq。结果表明，与菌株DT-8VF的基因表达数据相比，在菌株DT-8中总共发现了3110个具有统计学意义的差异基因（differential expressed gene，以下简称DEG），其中1741个上调，1369个下调（图1）。接下来，作者就通过对这些DEG进行功能分析来阐释DT-8内在的响应机制。

2. DEG的GO富集分析

作者发现，上调的1741个基因显著富集到22个GO terms中（图2a）。其中9个terms与DNA复制和DNA修复有关。此外，“碳水化合物跨膜转运”、“碳水化合物：质子同向转运蛋白活性”和“糖跨膜转运蛋白活性”也显著富集。这些结果表明，SsHADV-1的感染可能激活了菌株DT-8的DNA损伤反应并增强其碳水化合物获取。

另外，下调的1369个基因显著富集到10个GO terms中（图2b），其中三个terms与核糖体的结构和功能有关，即“核糖体亚基”、“胞质核糖体”和“核糖体结构成分”。同时，“翻译”相关terms以及两个与碳水化合物代谢相关的GO terms，即“碳水化合物结合”和“碳水化合物代谢过程”也被显著富集。这些terms可能与菌株DT-8的生长减弱有关。

图2

3. DEG的KEGG富集分析

上调DEG的KEGG富集分析显示出与GO富集分析相似的结果。对于1741个上调基因，显著富集的12条terms中有8条terms与DNA复制和DNA修复有关（图3a），再次表明SsHADV-1的感染可能激活了菌株DT-8的DNA损伤反应。

对于下调基因，也与GO富集分析类似，“碳水化合物代谢”、“淀粉和蔗糖代谢”、“核糖体”、“翻译”和“翻译因子”是KEGG富集的terms。此外，“脂质生物合成蛋白”也被富集（图3b）。这些途径也可能与菌株 DT-8的生长减弱有关。

图3

4. 菌株DT-8中关键的非同源末端连接（NHEJ）基因上调

在核盘菌基因组中，有2个Ku70/Ku80同源物（ssKu70，SS1G_02717；ssKu80，SS1G_07128）、1种DNA修复蛋白XRCC4（SS1G_02074）和1种DNA连接酶4（SS1G_03342）。Ku70-Ku80是一种异源二聚体蛋白，能与DNA结合，与DNA修复蛋白XRCC4和DNA连接酶 4形成复合物，激活NHEJ途径以修复DNA双链断裂。与菌株DT-8VF相比，所有关键NHEJ基因在菌株DT-8中均上调（图4）。 该结果表明SsHADV-1的感染激活了菌株DT-8中的NHEJ途径。

图4

5. 大多数抗病毒RNA沉默基因在DT-8菌株中被下调

RNA沉默被认为是一种针对外来核酸的适应性防御机制，广泛存在于动物、真菌和植物病毒。在核盘菌基因组中，有2个Dicer样（Dcl）基因、2个argonaute样（Agl）基因和3个RNA依赖性RNA聚合酶（RDR）基因。与菌株DT-8VF相比，除SsSDcl1（SS1G_13747）外，其他抗病毒RNA沉默基因在菌株DT-8中下调（图5）。这表明SsHADV-1可能抑制了宿主抗病毒RNA沉默从而得以在菌株DT-8中存活。

图5

6. SsHADV-1感染下调DT-8中毒力因子基因的表达

目前，核盘菌致病机制的研究主要集中在植物细胞壁降解酶（PCWDE）、毒力相关分泌蛋白和草酸（OA）上。在鉴定到的植物细胞壁降解酶（PCWDE）基因和效应子样小分泌蛋白中，Sspg2、Sspg1、Sspg3、Endo2、Ssv263、SSITL和Ss-rhs1在菌株DT-8中下调（图6a、b）。与对照菌株DT-8VF相比，除阳性转录因子基因Ss-Pac1外，草酸（OA）生物合成关键基因（Ss-Oah1、Ss-Pth2和Ss-Mls1）和降解关键基因（Ss-odc2）在菌株DT-8中均呈下调（图6c）。 这表明SsHADV-1的感染可能全面抑制了菌株DT-8的OA代谢。

图6

7. qRT-PCR 验证基因表达

为了验证UMI RNA-seq中获得的结果，作者通过qRT-PCR分析了部分核盘菌基因的相对表达水平。结果显示这些代表性基因的表达模式与转录组测序数据一致（图7），表明了转录组测序的可靠性。

图7

总结

在本研究中，作者利用UMI RNA-seq研究了SsHADV-1感染对核盘菌全基因组转录的影响。通过比较分析菌株DT-8与DT-8VF的基因表达谱，作者发现SsHADV-1感染下调了DT-8中参与碳水化合物、脂质代谢、核糖体组装、翻译和毒力因子相关基因的表达，这可能与菌株DT-8的生长减缓和低毒力有关。此外，SsHADV-1的感染还抑制了宿主抗病毒RNA沉默，这些DEGs也可能是SsHADV-1在菌株DT-8中成功寄生和复制的关键因素。这些结果为进一步解析SsHADV-1感染对核盘菌全基因组转录的影响提供了基础。

文献：

Qu Z ,  Fu Y ,  Lin Y , et al. Transcriptional Responses of Sclerotinia sclerotiorum to the Infection by SsHADV-1[J]. Journal of Fungi, 2021, 7(7):493. https://doi.org/10.3390/jof7070493