ChIP 实验分组
在 ChIP 实验正式开始前,我们会将样品超声破碎,然后分成 input、IP 和 IgG 组。
Input 组:样品超声破碎后会先取出一小部分,作为 input,input 不进行后续的 ChIP 实验,而是阳性对照,帮助我们了解样本的原始状态。input 含有样本的所有蛋白和 DNA、RNA 等物质。剩下的部分样本,分为两部分 IP 组和 IgG 组。
IP 组:使用蛋白特异性的抗体进行免疫沉淀(ChIP),获取我们感兴趣的目的蛋白及其结合的 DNA。
IgG 组:使用 IgG 代替特异性抗体进行免疫沉淀。由于 IgG 无特异性,理论上不结合任何蛋白,它是作为空白对照,用于排除其他因素(非特异结合)对 ChIP 实验的影响。
ChIP 实验
实验所用的目的蛋白抗体(或 IgG)与磁珠偶联。
IP 组中,偶联抗体的磁珠与样本孵育,抗体结合目的蛋白,然后利用磁珠的磁性进行分离、洗涤、将目的蛋白与样本中的其他物质(如非目的蛋白、非结合 DNA)分开,实现目的蛋白及其结合 DNA 的富集。
而 IgG 组中,偶联 IgG 的磁珠同样与样本进行孵育、磁性分离、洗涤等操作,但 IgG 无特异性结合、富集。
WB 检测 ChIP 结果
ChIP 实验之后进行 WB 检测。若 ChIP 实验成功,input 组的泳道包含目的蛋白及其他非目的蛋白,目的蛋白可被一抗和二抗结合,最终会显出条带。IP 组富集到目的蛋白,在相应位置也有条带。此外一抗的重链会被二抗结合,产生条带,IgG 组没有目的蛋白,仅在抗体重链位置出现条带。
质检结果示例
这是一个对小鼠的细胞成功进行组蛋白 ChIP 的项目,使用组蛋白特异性抗体,除 marker 外的泳道分别为 Input、IP 和 IgG。input 和 IP 组有目的蛋白的条带说明样本中有该组蛋白表达,并且 ChIP 实验成功的富集了目的组蛋白,而 IgG 组没有目的组蛋白条带,说明没有非特异结合,ChIP 效果非常好,IP 组和 IgG 组有抗体重链的条带,背景干净无杂带。