什么是MRD

癌症MRD（Minimal Residual Disease），微小残留病灶， 是指在癌症治疗期间或之后，尚未治愈或复发，体内仍残留少量癌 细胞。这些残留的癌细胞无法通过PET或CT扫描等成像技术检测到 ，而且患者通常没有明显的临床症状，因此导致贻误治疗时机。

临床应用

对实体肿瘤患者而言，MRD检测可以帮助临床指导 预后分层、早期干预、辅助治疗、疗效监测和复发监测。

含量低

ctDNA含量与肿瘤负荷正相关，肿瘤越大血浆中ctDNA含量越高。因此在肿瘤复发早期，肿瘤细胞量比较少，血浆中的ctDNA含量极低，可达万分位乃至十万分位水平。因此需要检测方法具备检测十万分位含量ctDNA的能力，同时对方法的准确性要求极高，错误率要低于十万分位。

解决方案

• 1、采用超高测序深度，增加检测灵敏度；
• 2、检测多个位点，增加ctDNA检出的几率；
• 3、采用高效的纠错技术，增加检测的准确性

假阳性

克隆性造血（clonal hematopoiesis，CH）突变是造血干细胞携带的突变。其含量与ctDNA相当甚至高于ctDNA含量。因此使用ctDNA进行MRD检测时，CH突变与真实的肿瘤来源体细胞突变无法被区分，导致结果的假阳性。因此需要去除CH突变的干扰。

• 1、对肿瘤组织DNA与正常组织DNA进行平行测序，鉴定出真实的体细胞变异，用于MRD检测。

康测MRD建库试剂盒，使用三个商业化标准品（菁良基因GW-OCTM800、LDT Bioscience LDT-999和科佰生物CBP940）进行了300次性能验证，在使用SNV Cutoff > 1的条件下，实现了 100%的特异性。

对十万分之五含量的ctDNA检测结果，每个样本平均检出7.1个变异（最少4个），远高于1。在对十万分之三含量的ctDNA检测中，20个阳性样本中有15个检测到≥2个变异，为MRD阳性。

综合所有测试结果，我们发现使用cutoff > 1的阈值，所有检测的Specificity均可达到100%。在十万分之五的 ctDNA含量下，Sensitivity也稳定在100%，十万分之三含量Sensitivity为75%（未达95%）。因此我们将该试剂盒的报告阈值定义为SNV > 1, LoD计算为十万分之五。

二代测序技术（NGS）在样本处理、文库制备和测序过程中均会产生不同几率的错误，累积背景错误率在1‰左右。在检测含量在1‰及以下的突变中，真实突变水平接近甚至低于背景错误，无法被有效区分，因此无法直接应用。如肿瘤患者血液中ctDNA的突变，含量在1‰以下，通常在1‰~0.1‰的水平。因此需要高效的纠错技术去除背景错误，以鉴定真实变异。

SMP靶向测序技术

为此，我们开发了SMP（链特异性多重PCR）靶向测序技术。SMP是一种基于不对称多重PCR平台、同时又拥有双链纠错能力的靶向测序技术。其核心在于创新性的引入了3标签体系。

该技术在每一个DNA双链分子的一端同时添加两种标记：一个UMI标记用于区分不同DNA，两个链分子标签（strand identifiers, SID）用于区分同一DNA的正链和负链。在单侧多重引物扩增之后，同一DNA的正链和负链带有相同的UMI标记，和不同的SID标记。分析时，通过UMI确定同一来源的DNA分子，再通过SID确定其链的来源，即可区分同一DNA分子的正链序列负链序列。通过还原正负链即可过滤掉所有的假阳性变异和检测错误。

本系统为“分析报告一体机”的核心功能之一。其主要功能为根据提供的待检测位点列表，设计用于不对称多重PCR的Tag引物池。该引物池合成后，和内参引物一起，对添加了SMP接头的DNA进行多重PCR靶向扩增，最终形成SMP测序文库。本系统对每一个待检测位点同时设计F和R两条引物， 均带有illumina的P7 tag，F和R组合不 扩增，仅分别和SMP接头上的P5 Tag 扩增。